
原理按年配资平台官方
常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统。
材料与仪器
实验材料:
293T细胞
试剂、试剂盒:
Na2HPO4、glucose、KCl、HEPES、CaCl2、无菌水ddw、NaCl
仪器、耗材:
展开剩余66%培养皿、Eppendorf管、培养箱
步骤
1. 铺细胞: 选择状态良好的293T细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish。
2. 20-24h后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染。下面就35mm dish为例,采用以下转染体系:
ddw: 105ul
plasmid: 2ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)
2M CaCl2: 16.5ul
2XHBS: 125ul
按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂。
先将前三者混匀, 最后加2XHBS。
一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入, 吹打至微现乳白色, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液。
另一种方法是, 加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定, 建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打), 之后步骤同上, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液。
常见问题
1.转染后培养 6h 进行甘油休克效果最佳,比培养 0h 直接进行休克转染效率升高584.4 %。
2.甘油休克时间为4.5min 时转染效果最佳,比不用甘油休克转染效率升高 130.8 %。
注意事项
1.HBSP 缓冲液的 pH 值在 6 .70 和 7 .10 时转染HEK 293T 细胞的效果不好 ,细胞成活率低, 有大颗粒状物体存在;pH 值在 6 .96 时转染效果好,细胞存活率高, 蓝染细胞明显。
2.未纯化的 lacZ-pShuttle 质粒转染 HEK 293T 细胞转染效率低, 细胞成活率很低,而纯化后的质粒转染效率高 ,蓝染细胞明显 。
参考来源:AbMole按年配资平台官方
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